La société Abstergo force Desmond Miles à revivre les souvenirs (et par conséquent les actions) de l'un de ses ancêtres, Altaïr Ibn La-Ahad, en utilisant une machine complexe qui décode la mémoire génétique : l'Animus. Ces souvenirs sont nécessaires à la société pour mener à bien un projet scientifique secret. Desmond se trouve donc « synchronisé » avec la vie de son ancêtre.

 

Altaïr, membre de la confrérie secrète des Assassins au xiie siècle, doit exécuter neuf hommes dispersés entre les villes de Damas, Acre et Jérusalem afin de retrouver son statut de maître Assassin qu'il vient de perdre lors d'une mission capitale dans le Temple de Salomon. Après chaque assassinat, Altaïr retrouve une partie de l'équipement et des capacités dont il avait été privé à la suite de sa destitution, lui permettant ainsi de poursuivre ses missions. Le jeune homme exécute ses cibles, sur ordre de son maître Al-Mualim dans le but de ramener la paix dans sa patrie natale. Ces « hommes à abattre » sont des personnages influents au sein de leurs villes respectives, à différents niveaux. Altaïr apprend au cours du jeu qu'ils font également tous partie de l'Ordre du Temple. Ces assassinats font suite au vol de l'Orbe d'Eden par la Fraternité des Assassins, qui l'avait reprise aux Templiers, eux-mêmes l'ayant déjà dérobé aux assassins. Cet artefact aurait des pouvoirs divins, selon Al Mualim. Entre autres miracles, il aurait ouvert la Mer Rouge en deux et été la cause de la guerre de Troie. Il aurait également été utilisé par le Christ pour changer l'eau en vin, et pourrait permettre à son possesseur de contrôler les esprits, et donc les hommes.

 

Au cours de l'aventure, on découvre qu'Abstergo est en réalité une multinationale qui réunit les Templiers du monde moderne et qui cherche à changer le monde. Elle est à la recherche d'objets ayant des pouvoirs semblables à ceux de l'Orbe d'Eden, et projette de les envoyer en orbite autour de la Terre à l'aide de satellites pour contrôler la totalité de la population mondiale. Abstergo est prête à tout pour arriver à ses fins, et n'hésite pas à commettre des enlèvements, des catastrophes écologiques, ou des meurtres.

 

Altaïr exécute les ordres, en se posant de plus en plus de questions après avoir vu ses victimes persuadées de faire le bien, de vouloir la même chose qu'Altaïr, mais il veut retrouver son honneur et se contente des explications données par Al-Mualim. À la fin des souvenirs accessibles à Desmond, le jeune Assassin de Masyaf se rend compte qu'il avait été victime de manipulation de son maître Al-Mualim, lui aussi ayant embrassé la cause des Templiers. Le mentor, ayant fait exécuter par son disciple tous ceux qui auraient pu se dresser sur sa route, se retrouve seul possesseur de l'Orbe. Il « active » le pouvoir surnaturel de l'artefact, et change radicalement ses intentions premières. Altaïr, prenant conscience que les crimes qu'il a commis avaient un but différent de celui qui lui avait été présenté, se voit dans l'obligation de s'opposer à Al-Mualim. Un combat à mort s'engage alors, s'achevant par le triomphe d'Altaïr.

 

De retour dans le présent, Desmond retenu depuis plusieurs jours déjà, entend un message en sortant de la machine. Ce message est destiné aux scientifiques chargés de s'occuper du projet et qui jouent aussi le rôle de geôliers. En entendant la communication, il comprend que le bâtiment dans lequel il se trouve est attaqué par des assassins modernes qui s'opposent à l'organisation qui le retient prisonnier, et que ces gens semblent être là pour le libérer. La tentative échoue, et Desmond reste prisonnier d'Abstergo, sans certitude sur son avenir. Le jeu se termine lorsque, laissé seul, il perçoit d'étranges signes écrits sur le mur de la chambre qui lui a été donnée. Ces symboles lui sont révélés par une des capacités de son ancêtre qu'il a visiblement acquise : la « vision de l'aigle ».